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01、復(fù)蘇

細胞復(fù)蘇的原則： 快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。

實驗前準備
將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。
細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。

取出凍存管
根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應(yīng)編號。
從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
約1-2min后凍存管內(nèi)液體完quan溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。

平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min離心3分鐘。

制備細胞懸液
吸棄上清液。
向離心管內(nèi)加入適量完quan培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。
用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞計數(shù)
細胞濃度以5×10 5 /ml為宜。

培養(yǎng)細胞
將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO 2 的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間根據(jù)細胞情況而定。

記錄復(fù)蘇日期
結(jié)果分析
判斷細胞復(fù)蘇成功與否，需要看復(fù)蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細胞，臺盼藍染色法檢測復(fù)蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細胞，得出細胞存活率）。
如果復(fù)蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復(fù)蘇的過程沒有問題。復(fù)蘇的細胞恢復(fù)到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數(shù)量。

×× 初學(xué)者易犯錯誤 ××
水浴鍋未提前預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃直接融化。
水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。
離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機損壞和細胞丟失。
一次復(fù)蘇細胞種類過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細胞交叉污染。

02、傳代

1.傳代密度過高
一旦細胞養(yǎng)太久至融合度過高（>90%）才傳代，容易使細胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞，即便再重新鋪盤傳代，細胞也無法回到原本的特性了。（如：單層細胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）。

解決方案
盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤。
細胞融合度：在細胞培養(yǎng)中指的是細胞在培養(yǎng)表面（培養(yǎng)皿/瓶）所占的比例。

2.傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養(yǎng)細胞，若細胞培養(yǎng)到 80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠，就無法在細胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導(dǎo)并活化細胞；總體細胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。

解決方案
細胞傳代時，要進行準確的細胞計數(shù)，確保鋪盤的密度。

如何確定細胞的正確初始接種密度?

美國細胞庫（ATCC）建議各類不同細胞株接種密度：
細胞類型 接種密度
常見腫瘤細胞株 2-4 x 10 6 viable cells/25cm 2
成纖維細胞株 2-4 x 106 viable cells/25 cm2
淋巴細胞/懸浮細胞 3-4 x 10 5 viable cells/ml
雜交瘤 2 x 105 viable cells/ml
成肌細胞 1-2 x 10 4 viable cells/ cm2 

03、凍 存

細胞凍存的基本原理： 慢凍
手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱），使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。

大家可以根據(jù)自身情況或者實驗條件選擇不同的凍存方式。

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。

細胞代謝過程需要各種蛋白酶的參與，而這些蛋白酶在環(huán)境溫度低于-70℃時會集體罷工，低溫貯藏的目的是通過超低溫使代謝活動近乎停止。細胞因此進入休眠狀態(tài)，使細胞“不會老"，可以長期保存。

因為凍融過程對所有細胞和組織都是有一定傷害的，因此，需要開發(fā)出有效的技術(shù)來防止細胞死亡和損傷。

這時，低溫保護劑就發(fā)揮出它的作用了。

低溫保護劑可保護細胞不受細胞內(nèi)冰凍影響，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等滲透型低溫保護劑。它們的作用機制包括：自由進入細胞，取代水，使冰點下降，充當鹽的二次溶劑，提高細胞膜對水的通透性。

但是，部分低溫保護劑在緩慢冷凍過程中雖然會保護細胞，但它們也會引起細胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標準的自制凍存液中，會含有血清，血清是用來降低細胞毒性的，但血清也不是完mei的。